做完RNA seq测序想要验证基因表达上调下调，还是购买烧钱抗体做Western blot之前先验证一下关键基因的表达都离不来荧光定量PCR实验，这就需要又快又准的设计好Real time PCR引物，今天小编就分享一下如何利用NCBI设计PCR引物。
首先介绍一下荧光定量PCR引物设计原则：
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；
2、引物GC含量一般为40%-60%，45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之间。
4、引物3’端的碱基一般不用A。A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6、尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增。
7、使用BLAST检索，确认引物特异性。
下面推荐Primer-BLAST在线引物设计网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，这个网站可以在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物,同时整合了Primer3和NCBI的Blast功能。那么如何使用Primer-BLAST呢？
1. 假设我们要设计human p53引物，登陆PubMedhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed，选择Nucleotide, 输入p53 human mRNA（基因＋物种＋mRNA），单击Search。
左侧选择mRNA，出现的第一条就是human mRNA的序列，点击进入。
选择FASTA格式，点击进入。
你就可以得到Human p53的mRNA序列。我们可以直接单击右侧的Pick primer。
2.直接跳到NCBI的Primer-BLAST页面，提交的界面主要包括四个部分：PCR template（模板区）, Primer Parameters（引物参数区）, 和Exon/intron selection（外显子内含子选择区），Primer Pair Specificity Checking Parameters（验证引物特异性）。
在PCR Template下方文本框中我们也输入FASTA格式的序列或Accession Number，或点击选择文件载入FASTA格式的文件。右侧可以设置正向引物和反向引物的起始和终止位置。在Primer Parameters模块，可以输入PCR产物的大小（PCR product size）和Tm值参数。如何你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏，可以在此输入。一般产物短设为大小最小值50，最大值设为300。引物Tm温度接近，设置差2℃。
选择引物设计跨越内含子，限制基因组DNA扩增。
3.Primer Pair Specificity Checking Parameters验证引物的特异性，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这里提供了6种数据库：RefSeq mRNA, Refseq representative genomes，nr，RefseqRNA(refseq_rna)，Genomes for selected organism, Custom。推荐使用Refseq representative genomes数据库，Custom可以使用自己的序列作为搜索数据库。
用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。跟其它的BLAST一样，点击底部的Advanced parameters有更多参数设置，但一般不用再增加参数设置了。
4．单击Get primers，有时可能需要耐心等待一会，
出现结果界面，下图是引物的可视化结果，该结果会显示出所有引物的起始和终止位置，基因的CDS区，外显子的位置等。
以及会给出每一个引物对的具体信息，包括引物序列，长度，起始终止位置，Tm值，GC含量，自身互补和3’端互补情况，PCR产物的长度和位置等。其中，Self complementarity和Self 3 complementarity的值越小越好。
根据小编最开始总结的引物设计原则，从出现的引物选择里，第三条引物我们可以使用，把序列复制下来发给引物合成公司就可以啦。
当然引物设计也可以使用其他很多在线网站，例如Primerbank等，小编还是喜欢用NCBI，或者直接从文章Method里寻找粘贴到NCBI这个primer design tool对引物进行评价。今天又和小编学习如何快准狠设计荧光定量PCR引物，是不是很简单呢？
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