多肽的固相合成(多肽的固相合成技术)
聚合物载体和固相合成肽的连接分子
1。聚合物载体固相合成多肽需要固相载体和连接分子将固相与反应物连接起来。载体和连接分子的正确选择决定了固相合成的成功。固相合成肽的载体多为聚苯乙烯、二乙烯苯与苯乙烯共聚物等高聚物的衍生物，如氯树脂、Pam树脂、王树脂和氨基树脂。树脂的溶胀状态对缩合试剂和羧基组分的自由扩散、肽链间的聚集以及其他与缩合反应有关的因素有明显的影响。为了使载体具有良好的溶胀性能，并具有足够大的 *** 空以容纳不断增长的更长肽链，并便于反应物进入载体内部，一般使用交联度为1% ~ 2%的聚苯乙烯珠树脂或微孔树脂。
2。连接分子固相合成肽使用了与不同连接分子结合的聚合物，这些连接分子是含有氯甲基、巯基甲基、酰氯、对苯甲酰基、芳基磺酰氯、烯丙基、琥珀酰基、邻硝基苯甲醇和二苯基氯硅烷的双功能化合物。一个理想的接头分子在整个合成过程中必须非常稳定，并且合成后可以定量切割，不会破坏合成的目标分子。根据与树脂连接的肽的C-末端的结构类型，合适的接头分子应该被切割以产生相应的衍生物，例如羧酸、酰胺或氨基醇。
固相合成肽的检测
即使偶联技术高效，也不能保证100%的酰化反应。此外，当遇到空间位阻或β 2层状序列时，偶联反应的效率大大降低。聚合物载体上总有缺失或截短的多肽链，它们在释放时也会进入产品，给分离带来很大困难。所以固相肽合成时每个氨基酸的缩合率都要达到99.9%，尤其是长肽，否则产品会很不纯。因此，监控每个反应步骤的进展非常重要。(杭州专肽生物有20多年的固相合成经验，可以满足大部分客户的需求。)
1定性显色反应茚三酮比色法(Kaiser法)是通过茚三酮显色反应快速测定树脂上的氨基，从而判断酰化反应是否完全。茚三酮法检测聚苯乙烯树脂中氨基的灵敏度可达5 μ mol/g，以此灵敏度可检测缩合反应是否超过99%。检测茚三酮时，由于末端氨基酸残基和序列的不同，颜色强度也不同。天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)会产生淡蓝色或浅棕色。显色剂2，4，62三硝基苯磺酸与树脂上的氨基反应呈橙红色，灵敏度为5μmol/g树脂。
Kaiser试剂包括:
a、6%茚三酮的乙醇溶液
b、80%苯酚的乙醇溶液
c、2%0.001MKCN的2%吡啶溶液
制备的吡啶需要用茚三酮处理，然后重新蒸熟后才能使用。检测过程中，取少量树脂，分别加入A、B、C各2-3滴，100℃加热1-2分钟。如果溶液呈蓝色，或者树脂呈蓝色或红棕色，说明还有游离氨基；否则，连接完成。检测游离氨基还有其他方法:三硝基苯磺酸法、苦味酸法、溴芬法等。
2游离氨基的定量测定水杨醛法用于测定肽接枝后树脂上残留氨基的量和除去保护基后氨基的总量。可以定量检测缩合反应和脱保护基反应是否完全。如果不完整，可以及时反复处理。用2%水杨醛+6%吡啶乙醇溶液与树脂上的氨基反应(60℃，30 ~ 35分钟)。清洗后，用5%苄胺乙醇溶液(60℃，30分钟)替换水杨醛。用苄胺乙醇溶液稀释后，在315nm处读取吸光值，计算氨基数量(ε = 4.33)。对于NH2大于0.15μmol/mg树脂的样品，该方法的相对偏差小于5%。
3部分保护的中间体肽的HPLC检测在肽合成过程中，将少量的肽树脂(3 ~ 10 mg)裂解，用乙醚沉淀，溶解在适当的溶剂中，直接进行HPLC分析。当肽被切割时，N-末端保护基团根据需要被保留或去除。当合成的肽为短极性肽时，可以保留保护基，否则在HPLC中保留时间太短，不利于分析。这种方法虽然麻烦，但耗时短，准确率高。
反应溶剂
二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)是多肽固相合成中常用的溶剂，尤其是DMF因其对反应产物和产物的高溶解性而被广泛应用于许多反应体系中。DMF虽然溶解度较好，但沸点较高，需要减压蒸发。此外，副产物N-酰基脲在高介电常数的溶剂中容易产生[〔DMF，乙腈(CH3CN)，二甲基亚砜(DMSO)，H2O等。]，而在低介电常数的溶剂(CH2Cl2、CCl4、C6H6等)中不易产生。).在非极性溶剂中，N-保护氨基酸能迅速与DCC反应生成对称酸酐。所以只要能溶解反应物，就尽量选择介电常数低的溶剂。在固相合成中，DCM多用作溶剂，它有两个优点:比DMF消旋率小，N-酰基脲生成慢。当羧基成分难以溶解时，可以加入几滴再蒸的DMF帮助溶解。
缩合试剂主要有:碳二亚胺型和鎓盐型(Uronium)。
碳二亚胺类型
主要有DCC、DIC、EDC。HCl等。DCC用于该反应。由于反应中生成的DCU在DMF中溶解度很小，会产生白色沉淀，所以一般不用于固相合成。但由于其价格低廉，在液相合成中可通过过滤除去，应用仍相当广泛。因为它的水溶性，EDC。HCl广泛应用于肽和蛋白质的连接，而且相当成功。但这类缩合试剂更大的一个缺点是，如果单独使用，副反应会比较多。但研究表明，如果在活化过程中加入HOBt、HOAt等试剂，可以将副反应控制在很低的范围内。
盐类型
盐缩合试剂反应性高，速度快，目前应用广泛，包括H *** U、T *** U、HATU、PyBOP等。试剂使用过程中需要添加有机碱，如二异丙基乙胺(DIEA)和N-甲基吗啉(NMM)。只有加入试剂后，氨基酸才能被激活。
固相合成工艺
1.以羟基树脂为载体的合成方法(以王树脂为例:图1)
王树脂、PAM树脂、树脂和Sasrin树脂都在接头结构中含有苯甲醇基团。在大多数情况下，预先形成的N-保护氨基酸的对称酸酐和催化剂DMAP(对二甲氨基吡啶)与羟基树脂反应。在这个结合反应中。DMAP是必要的，但它也带来一些麻烦。比如当一些空间位阻大、反应活性低的Fmoc-氨基酸需要较长的反应时间，DMAP的纯度不理想时。一些Fmoc基团被除去并产生一些二肽。更常见的危险是，当Cys和His作为C端之一个氨基酸与羟基树脂反应时，DMAP倾向于将这两个氨基酸外消旋化。所以解决的办法就是用Cl-Trt树脂把这两个氨基酸键合起来，也可以产生酯基接头。另一种解决方法是使用MSNT试剂[Fra I388，Ren 1998]，可以有效避免Cys和His与各种羟基树脂键合时的外消旋化危险。
图1固相肽合成
2.以三苯甲基树脂为载体的合成方法(图2)
三苄基(trt)树脂含有三苄基结构，因此具有很高的反应活性。通常，将等摩尔量的受保护氨基酸和4倍量的DIEA与Trt树脂在二氯甲烷中混合，在室温下30-12分钟后反应完成。对于没有完全反应的位点，可以用甲醇封闭。基于Trt连接体的温和键合和温和裂解的特性，在这种树脂上浓缩皮片和制备完全保护的皮片是一种理想的方法。
图2固相肽合成
FMOC固相合成谷氨酸色氨酸
作为载体的氨基树脂的合成方法
MBHA树脂、PAL树脂、Knorr树脂、Rink-NH2树脂等。都含有能与连接基中的羧酸反应的氨基。在C-末端结合之一个氨基酸的反应条件与肽接枝循环中的反应条件完全相同。如果DCC用作缩合剂，通常，N-保护的氨基酸与DCC和HO *** 在溶剂(DMF、THF、DCM等)中混合。)生成HO *** 活性氨基酸酯，静置3-5小时。活化反应基本完成后，滤出副产物DCU沉淀，将羧基活化组分溶液与氨基树脂混合进行键合反应。这个反应有两点值得注意:①大部分氨基树脂的氨基都不是以游离状态出售的。一些氨基以盐酸盐的形式存在，而另一些氨基则具有临时保护基团(如Fmoc、Boc等。).因此，在与C-末端的之一个氨基酸结合之前，必须进行相应的中和或去除临时保护基团。②氨基酸活化组分的用量应远高于氨基树脂组分的用量，一般摩尔比为(2-5): 1，才能使键合反应接近100%，因为未酰化的氨基树脂不能从产物中除去。使用大量过量的结构单元是所有固相有机合成中常见的。
除了DCC，其他常见的冷凝剂有DIC、EDC、EEDQ、H *** U等。
